通過網絡藥理學和動物實驗，初步探究紅曲治療腦小血管病（CSVD）的作用機制
發布時間：
2022-05-23
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摘要∶
腦小血管病（CSVD）是直徑介于40～200 μm 的腦血管病變引起的綜合征"1，臨床表現為腦白質病變、腦微出血、腔隙性梗死等。研究表明，CSVD與癡呆、卒中等疾病關系密切，約有45%的血管性癡呆和20%的缺血性卒中由 CSVD引起。西醫治療CSVD主要通過溶栓藥、降壓藥、抗血小板等早期干預，效果不佳且不良反應較大。中醫理論認為CSVD屬"絡病"范疇，治法為扶正祛邪，中藥治絡病效果顯著，不良反應較少，已成為近年來的研究熱點。
紅曲（red yeast rice，HQ）為藥食兩用中藥，生產歷史悠久，藥用記載始干《飲膳正要》。2020年版《中國藥典》5記載紅曲為紫色紅曲霉Monascus purpureus Went 寄生于粳米發酵而得。其味甘，性溫，無毒、歸肝、脾經，有活血化瘀、通經活絡功效。現代藥理研究表明，紅曲成分中Monacolin K及其衍生物、紅曲色素、y-氨基丁酸等具有顯著的降血脂、降血壓、神經保護、改善微循環等作用，提示紅曲可作為治療 CSVD的潛在藥物。
網絡藥理學是基于生物信息學、藥理學等的綜合性學科，通過構建生物分子互作網絡，系統化詮釋分子作用機制。因此，本研究基于網絡藥理學研究方法構建紅曲"藥物-成分-靶點"網絡，獲取相關成分、靶點、通路信息，通過動物實驗對網絡藥理學結果進行驗證，探討紅曲治療CSVD的物質基礎和分子機制。
目的
通過網絡藥理學和動物實驗，初步探究紅曲治療腦小血管病（CSVD）的作用機制。
方法
通過 PubChem、SwissTargetPrediction等數據庫獲取紅曲成分及作用靶點，運用GeneCards、OMIM等數據庫獲取 CSVD的疾病靶點，結合Cytoscape 3.7.1軟件構建"藥物-成分-靶點"網絡;取交集靶點輸入STRING 11.0數據庫，構建PPI網絡;利用DAVID6.8數據庫進行GO和KEGG分析。建立大鼠CSVD動物模型，通過Morris 水迷宮、HE染色、ELISA、Western blot等驗證網絡藥理學分析結果。
結果
篩選出43個活性成分，37個關鍵靶點，GO 分析結果涉及神經炎癥、細胞增殖等，KEGG結果涉及 PI3K-Akt和RAS信號通路等;動物實驗結果顯示，紅曲干預后可顯著改善CSVD大鼠海馬CA1區損傷，降低血清中IL-6、IL-1βB、TNF-α炎癥因子水平，上調 PI3K/AKT/mTOR蛋白的表達。
結論
本研究結合動物實驗對網絡藥理學預測結果進行驗證，發現紅曲可能通過調控 PI3K/AKT/mTOR通路改善CSVD模型大鼠的癥狀，為紅曲的臨床應用提供依據。
關鍵詞∶
動物實驗;網絡藥理學;紅曲;腦小血管病;分子機制
討論：
CSVD是臨床常見的腦血管疾病，與高血脂、高血壓等危險因素關系密切。中醫理論尚未明確定義CSVD、通常認為其屬于絡病，病位在腦，由濁邪入血，入髓傷髓所致。臨床治療CSVD應以活血化瘀、化濁益髓的中藥為主1。紅曲具有活血化瘀、健脾消食的功效，臨床上常用的中成藥血脂康、脂必妥均以紅曲為主要成分，廣泛用于治療高血脂、動脈粥樣硬化、心腦血管病等，可作為治療CSVD的潛在藥物。
本研究運用網絡藥理學方法篩選獲得Monacolin K、Ankaflavin、GABA等43個紅曲 活性成分，PIK3CA、MTOR、MAPK1等1126個腦小血管病靶點;PPI網絡分析共發現91個節點，752條邊，平均Degree值為16.7、獲得EGFR、MAPK1、ESR1等37個關鍵靶點;GO分析結果涉及171個生物過程、33個細胞組分、51個分子功能，主要涉及神經炎癥、信號轉導、細胞增殖等。研究表明，神經炎癥在腦血管疾病的發展中起重要作用，降低相關炎癥因子如TNFα、IL-6、IL-1β等水平，可改善血腦屏障通透性，減輕腦組織損傷促使大腦結構功能恢復正常。KEGG分析結果得到104個通路.主要有PI3K-Akt、Rapl、RAS 通路等.P3K-Akt通路研究較為廣泛，其在腦卒中、血管性癡呆等疾病的治療中起著重要作用。Qi等研究發現3-丁基苯酞（NBP）能通過激活 PE3K/Akt信號通路抑制CSVD大鼠神經細胞凋亡，恢復細胞基本功能，提高大鼠學習記憶能力。Cha等1研究表明人參皂苷Rg，可通過 PI3K/Akt mTOR 信號通路增加缺血性卒中后血管內皮生長因子的表達，促進腦內血管生成，改善腦血流量。
本研究選擇不同劑量紅曲干預CSVD模型大鼠，探究其作用機制，對網絡藥理學研究結果進行驗證。Morris水迷宮實驗結果顯示，紅曲能顯著縮短CSVD大鼠的逃避潛伏期，增加穿越平臺次數. 表明紅曲顯著改善CSVD模型大鼠的短期學習記憶能力;HE病理切片結果顯示紅曲治療組大鼠海馬CAl區細胞形態完整、排列整齊，核仁和胞漿界限清晰，不同劑量紅曲治療組海馬 CA1區病變程度均有明顯改善，高、中劑量效果較為明顯;網絡藥理學GO分析結果表明，紅曲治療CSVD可能與神經炎癥、細胞增殖、信號較導等生物過程相關，其中神經炎癥在CSVD發展過程起重要作用。生化指標結果顯示∶不同劑量紅曲治療組可顯著降低CSVD模型大鼠血清 TNFa、IL-6、IL-1β炎癥因子水平。其效果呈劑量依賴性;網絡藥理學研究結果顯示紅曲中 Moracolin類、紅曲色素等為其活性成分，本研究結果中紅曲能顯著降低TNF-a、ⅡL-6、IL-1水平可能與上述成分有關。KEGG分析結果顯示.涉及CSVD的有PI3K-Akt、RAS、Rapl信號通路等。研究表明 PI3K-Akt信號通路可通過調節下游把蛋白mTOR活性。參與自噬清除β淀粉樣蛋白的沉積、恢復細胞功能等發揮神經保護作用12-1網;Western blot結果表明.與假手術組相比.模型組PI3K、AKT、mTOR蛋白水平顯著降低∶ 與模型組相比.紅曲治療組可不同程度增加 PI3K、AKT、mTOR蛋白水平.提示紅曲可通過上調 PI3K/AKT/mTOR蛋白的表達.參與調控神經元細胞增殖、分化、凋亡等發揮治療CSVD的作用。
綜上，通過網絡藥理學和分子對接，構建紅曲治療CSVD的成分、疾病、作用靶點、相關通路之間的復雜網絡關系，展現了中藥多成分、多靶點、多途徑的治療優勢。通過Morris水迷宮，海馬組織HE染色.TNF-a、IL6、IL-1β炎癥因子檢測，PB3K、AKT、mTOR蛋白測定等實驗驗證網絡藥理學預測結果.初步揭示了紅曲治療 CSVD的藥效機制，可為后期深入探究其治療CSVD機制提供理論依據。
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