動物模型泛地應(yīng)用于卵巢癌的研究卵巢癌動物實驗?zāi)Ｐ驮炷７椒ǜ攀?

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2022-05-25

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卵巢癌動物模型的發(fā)展很大程度上推動了卵巢癌的研究，有利于從多角度進行卵巢癌研究。基因工程小鼠（GBM）、同基因型腫瘤模型、異種移植瘤模型、活體動物體內(nèi)成像技術(shù)，這些技術(shù)的發(fā)展使得卵巢癌動物模型研究更加完善

　　摘要∶
　　卵巢癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，易發(fā)生廣泛的腹腔內(nèi)轉(zhuǎn)移，且預后較差，死亡率較高。近年來關(guān)于卵巢癌的研究越來越多，動物模型也廣泛地應(yīng)用于卵巢癌的研究中。建立卵巢癌動物模型有利于研究其誘導因素，發(fā)病機制，病理演變，病變轉(zhuǎn)移，以助于卵巢癌的早期發(fā)現(xiàn)。同時卵巢癌動物模型還可應(yīng)用于卵巢癌治療藥物的藥理學研究，以改善治療方案及預后。文章就常見卵巢癌動物模型分類，建立方法及應(yīng)用做一概述。
　　關(guān)鏈詞∶
　　卵巢癌;動物模型;動物造模方法
　　簡介
　　卵巢癌是常見的婦科惡性腫瘤疾病之一，因其病位居于盆腔深部，發(fā)病極具隱匿性，卵巢惡性腫瘤早期篩查及診斷困難，大多數(shù)患者首次就診時已為晚期，錯過了手術(shù)治療的最佳時機，致死率高，嚴重威脅女性身心健康。據(jù)國際癌癥機構(gòu)（IARC）發(fā)布的《2020 年全球癌癥統(tǒng)計》顯示，卵巢癌在該年全球女性新發(fā)癌癥中占比，3.4%，死亡率在其中占比4.7%，在女性癌癥發(fā)病及死亡順位中均為第 8 位1。在我國卵巢癌在女性惡性腫瘤及死亡順位中位居第11位及第9位。因此近年來，卵巢癌越來越受到關(guān)注，研究者們通過多種卵巢癌動物模型的建立及應(yīng)用探討卵巢癌的發(fā)生機制、發(fā)病規(guī)律及治療方案。目前，常用的卵巢癌模型有自發(fā)性卵巢癌動物模型、誘導性卵巢癌動物模型、移植性卵巢癌動物模型、基因工程卵巢癌動物模型，現(xiàn)對動物模型總結(jié)如下。
　　1 自發(fā)性卵巢癌動物模型
　　自發(fā)性腫瘤動物模型是不經(jīng)人為條件處理，自然產(chǎn)生的，是在長期動物實驗過程中發(fā)現(xiàn)的易患該種疾病的動物品系，并人為促使其繁殖而形成的動物模型。現(xiàn)階段常用的卵巢癌自發(fā)性動物模型包括小鼠、東方田鼠及長爪沙鼠。其中因小鼠基因與人類基因的相似度高達 95%，所以小鼠自發(fā)性腫瘤實驗結(jié)果類比干人有較大的優(yōu)熱，故本文主要以小鼠進行闡述。實驗人員在長期飼養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)以下小鼠品系中自發(fā)性卵巢癌的發(fā)病率較高∶RIⅢ系17月齡雌鼠卵巢影發(fā)病率在 50%～60%、C3H 系中C3HeB/Fe19月齡雌鼠卵巢癌發(fā)病率為22%～64%、CE 系推鼠發(fā)病率為33%。日發(fā)現(xiàn)同品系小鼠之間生產(chǎn)雌鼠較育成雌鼠發(fā)病率高【3】。腫瘤形成后可見腹部包塊，解剖提取卵巢包塊進行病理切片，可見癌細胞可判斷模型建造成功。
　　自發(fā)性卵巢癌動物模型能夠完整地再現(xiàn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程，便干實驗人員觀察卵巢癌的發(fā)病機制及病理演變過程，發(fā)現(xiàn)新的誘導因素，有利于進行臨床卵巢癌的早期發(fā)現(xiàn)。同時實驗所產(chǎn)生的自發(fā)性卵巢癌腫瘤可用干種精性腫瘤的細胞來源。但該種建模方法所需實驗周期較長，實驗動物體內(nèi)環(huán)境不能完全與人體內(nèi)環(huán)境相同，體內(nèi)免疫機制與人體免疫機制不同，其病理進程與臨床病情仍存在較大出入，因此現(xiàn)階段較少在實驗研究中應(yīng)用。
　　2 誘發(fā)性卵巢癌動物模型
　　誘發(fā)性腫瘤動物模型是指通過物理或化學方法人工誘導實驗動物發(fā)病，生成腫瘤。在卵巢癌實驗研究中，大多以大鼠為實驗動物，使用化學物質(zhì)二羥甲基廠酸（DMBA）作為致癌物質(zhì)，誘導實驗動物發(fā)病。在查閱資料時發(fā)現(xiàn)許多研究人員采取誘發(fā)模型進行卵巢癌的相關(guān)研究，其建模方法雖各有差別但大部分采用【MBA 埋線法進行誘導，該方法最早由 SEKIYA等于1975年采用，并成功誘導出卵巢癌模型，后經(jīng)多位學者驗證。KANTER等于2006年在上述方法的基礎(chǔ)上構(gòu)建出了新的誘導模型-4-乙烯基-1-環(huán)己烯二環(huán)氧化物（-VCD）聯(lián)合MIBA 誘導法，這種方法是先運用 VCD使實驗動物產(chǎn)生卵巢早衰后用 DBA 誘導卵巢癌的發(fā)生。
　　下面將針對這兩種誘導模型的建立方法進一步論述.
　　2.1 卵巢包埋DMIRA布片法
　　黃以萍等采用該種方法成功誘導大鼠卵巢癌模型具體方法如下1。首先將 DMBA 加熱至融化，后按照實驗動物卵巢體積采取合適大小的布片，將布片浸泡于融化的BA中，-20℃冷藏保存。選取6周齡雌性實驗動物稱重記錄后麻醉.待麻醉成功后選取雙側(cè)卵巢位置開題。尋找卵巢。將 DB4 布片經(jīng)貼哪巢包理在脂助下。逐層關(guān)感，后結(jié)喂養(yǎng)觀察實驗動物情況，術(shù)后32 周后卵巢癌誘發(fā)率為 6錢，基本為上皮性師巢癌，均一性較好。
　　2.2 4-乙烯基-1-環(huán)己烯二環(huán)氧化物（-V①D）聯(lián)合DIBA 誘導法
　　實驗研究表明每日予大鼠 4-乙烯基-1-環(huán)己烯二環(huán)氧化物（-VCD）可導致大鼠卵巢激素水平改變，發(fā)情周期素亂，卵泡數(shù)量減少，卵巢縮小。最絡(luò)導致卵巢功能衰竭。故而4-乙烯基-1-環(huán)己悟二環(huán)氧化物（VQD）常用做誘導大鼠卵巢早衰的實驗試劑"問，也可前期運用VCD.胸腔注射給藥，通過觀察大鼠發(fā)情情況來推測其卵巢早衰進程，當出現(xiàn)發(fā)情不規(guī)律時將MIBA浸泡的縫線包埋入大鼠卵巢，誘導大鼠卵巢癌的發(fā)生。
　　誘發(fā)性卵巢癌動物模型所產(chǎn)生的動物模型與人體模型病因?qū)W、人體腫瘤細胞動力學較為相似，可以較完整模擬卵巢癌在人體發(fā)病、演變的全過程。有利于卵巢癌預防和早期化療的研究。但誘發(fā)性卵巢癌模型發(fā)生步驟雖然與人體極為相似。但是其誘導產(chǎn)生的卵巢癌類型不易控制，黃以萍等在實驗中發(fā)現(xiàn)其誘導實驗所建造的卵巢癌模型多為卵巢漿液性腺癌。而卵巢粘液性腺癌和卵巢透明細胞腺癌這兩種臨床預后最差的類型在實驗中的發(fā)生率僅為 1.3%和 2.0%。誘發(fā)性卵巢癌的惡性程度也與臨床不盡相同。
　　3 移植性卵巢癌動物模型
　　移植性腫瘤動物模型即把人或動物的腫瘤移植到同系、同種或者異種動物體內(nèi)，現(xiàn)階段移植性卵巢癌動物實驗常用實驗動物多為小鼠，提鼠和大鼠。腫瘤來源可分為同種可移植腫瘤--自發(fā)性腫瘤、誘導性腫瘤，異種可移植腫瘤一人臨床實體瘤和人卵巢癌細胞棟。移植部位多選取皮下、卵巢移植。或者為研究卵巢癌的轉(zhuǎn)移情況、轉(zhuǎn)移癌的治療選取腹腔、淋巴移植。在查閱大量文獻的基礎(chǔ)上，我將從實驗動物，腫瘤來源及處理方法，移植部位及方法這三個方面詳細論述。
　　3.1 實驗動物的選擇
　　移植性卵巢癌動物模型常用動物有小鼠，裸鼠和大鼠。小鼠常用的品系是 BALB/c 小鼠、SCID 小鼠、C57BL/6J 小鼠。蔡智慧等"應(yīng)用 B.AB/c 雌性小鼠成功復制卵巢癌皮下種植模型，歐陽媛等一成功建造 NOD SCID 小鼠原位成瘤模型，張濤等構(gòu)建NSG小鼠卵巢皮下移植痛癌模型。小鼠作為實驗動物起初較少選取人源腫瘤進行移植，但宿主抗人組織的免疫排斥問題的解決，T、B、NK三系免疫細胞缺陷 NOD/SCID小鼠的應(yīng)用。患者源性異種移植逐漸開始被多數(shù)學者所選擇。所以現(xiàn)階段多種來源腫瘤皆可應(yīng)用于小鼠模型。在移植部位的選擇上，由于小鼠體積較小。60%以上選擇皮下移植。但也可進行卵巢原位移植，首次小鼠卵巢原位移植是由 FU 等4于1993年首次嘗試并建造成功.
　　先天性無胸腺小鼠，T淋巴細胞功能缺陷小鼠一棵獻，因其個體之間可以保持同種遺傳性及生物學特性的特點，且其個體差異較小.重復性與可比性較高，在1969年由 YGAD等一首次應(yīng)用，是建立腫瘤模型常用的實驗動物。根據(jù)查閱握鼠卵巢癌模型相關(guān)論文發(fā)現(xiàn)各種來源腫瘤皆可應(yīng)用于提鼠模型。提鼠模型的種植都位也可選擇皮下，卵巢原位、腹腔移植、淋巴移植。裸鼠模型比其小鼠和大鼠模型比較，其應(yīng)用更多。
　　但由于模鼠免疫缺乏的特點。無法模擬腫瘤細胞在機體內(nèi)生長所產(chǎn)生的免疫反應(yīng)，同樣不能完全模擔腫痛的發(fā)展過程，且對治療藥物的效果也無法精準體現(xiàn)。而大鼠具備免疫功能，可以較好地模擬人卵巢癌的發(fā)展過程，常用于病理學研究、藥效研究、藥物篩查及相關(guān)干預因素研究。常用的卵巢癌大鼠品種有Fischer 大鼠"明、SD 大鼠P可等.
　　在實驗動物的選擇上首先要從實驗?zāi)康某霭l(fā)進行選擇，同時若要進行多次傳代移植時要盡量遵循同源移植。以保證移植的腫瘤不發(fā)生或最大程度地減少發(fā)生排斥、退化和變異。除此之外卵巢癌模型動物選擇時應(yīng)注意實驗動物的月齡。
　　3.2 腫瘤未源分類及處理方法
　　3.2.1 人體腫瘤異種移植

　　腫瘤來源為臨床卵巢癌腫瘤，周艷艷等'選取臨床實體腫瘤，建立裸鼠皮下卵巢癌模型以探討萊藜對卵巢癌裸鼠生長的影響、IEE 等=一4也成功應(yīng)用人實體瘤建造裸鼠卵巢癌模型。經(jīng)大量實驗研究發(fā)現(xiàn)，人體腫瘤初代移植成功率較低，平均只有 30%，故大多學者采用多次傳代移植，初代取實體瘤進行皮下種植，再將成功成瘤的瘤體進行分離、處理、再移植。其成功率約為 60%～70%。但由于臨床卵巢癌類型不同。人源性腫瘤可以保證動物模型成瘤的類型。有利于進行藥效研究，但其需要進行多次傳代移植，故而試驗周期較長，成本較高。
　　3.2.2 腫瘤細胞株異體移植

　　細胞株移植法成功率較高，是現(xiàn)階段應(yīng)用較廣的腫瘤移植類型。常見的卵巢癌細胞株
　　有SSOV3細胞株、H0-8910細胞株、A2780細胞株、ID8細胞棟、C0C1細胞棟、BS-2細胞棟、CAOV-3細胞株和 0CAR-3 細胞棟等。腫瘤細胞棟異體移植實驗前要進行細胞扶體外培養(yǎng)。將購買的細胞族在含此牛血清的培養(yǎng)液中進行培茶，要注意及時更換培養(yǎng)液。或者添加青霉素或其他抗菌素以防其他細菌滋生。待腫瘤傳代數(shù)量足夠后，收集對數(shù)生長期細胞進行移植。宋燕琳及其團隊的研究學者問通過對提鼠皮下注射人上皮性卵巢漿液性毒膜癌細胞H0991GPM （FSHR 陽性）及SKOW3（SER陰性），成功建立出了人卵巢癌細胞動物模型。旺E 等應(yīng)用此方法在小鼠卵巢中注入 ID8 細胞。成功備卵巢癌原位模型;ROS4等"研究學者在SIC模鼠胸腔內(nèi)注射SS、SKCC%2細胞，成功備提鼠卵巢癌模型∶任萍等i=將綠色熒光蛋白（GP）轉(zhuǎn)染后的SKOWV3 細胞以一定濃度種植于 MOD-SCID 鼠卵巢建立了卵巢癌原位模型。通過查閱文獻發(fā)現(xiàn)，近年來人卵巢癌HO-8910細胞株的較為廣泛，郭秀霞等問應(yīng)用人卵巢癌 HO-8910細胞株建立了模鼠卵巢癌模型∶夏紅等一向提鼠腹腔注射 H0-8910細胞株建立卵巢癌動物模型。
　　應(yīng)用細胞懸液進行移植較為方便，適合進行腹腔轉(zhuǎn)移模型、淋巴轉(zhuǎn)移模型的建立，但形成卵巢癌類型不可控。要具體實驗具體分析。
　　3.2.3 同種可移植腫瘤

　　同種可移植瘤即自發(fā)性或誘發(fā)性模型動物實驗中形成的腫瘤。經(jīng)過人為處理后移植進相同種屬實驗動物體內(nèi)。同種移植瘤正常速度較快，機體排斥反應(yīng)較輕。同為瘤組織移植，成功率要高于臨床人痛組織移植。其瘤體處理方法同臨床實體瘤相似。但應(yīng)注意移植實驗動物種類要同腫瘤來源的實驗動物相同。該種來源腫瘤因取自自發(fā)性或誘發(fā)性試驗?zāi)Ｅe.實驗周期相對較長，種植部位以往大多選取皮下或卵巢原位移植。3.3 種植部位的選擇及方法卵巢癌模型常用種植部位有皮下，爪墊皮下、卵巢及腹腔，皮下移植操作簡單，但不能完個模擬瘤體在卵巢內(nèi)的生長，太多用于藥效的研究。爪擋皮下淋巴管較為豐寬。成單向淋巴引流，便于進行服巢癌淋巴轉(zhuǎn)移的研究。種植方便，成痛率高，易于觀察。但建模成功后不易進行定量分析研究。卵巢原位移植可完整模擬腫瘤在卵巢癌內(nèi)的生長過程，有利于進行病理及藥理的研究，但由于實驗動物卵巢體積較小，實驗操作難度較大。臨床上卵巢癌易于向腹腔轉(zhuǎn)移，腹腔種植模型的建立有利于模擬這一轉(zhuǎn)移過程，并對卵巢癌腹腔轉(zhuǎn)移后的治療進行研究。
　　3.3.1 皮下種植模型的建立

　　①瘤組織組織塊移植∶常用的方法為穿刺針法。首先抓取動物。固定，選好皮下種植部位并消毒，用合適型號的套管針將剪好的瘤組織移至小鼠皮下。

　　②腫瘤細胞懸液種植∶懸液種植常用部位為頸背部皮膚。抓取動物并固定，消毒局部皮膚。一般按照每只動物0.2mL.懸液進行注射。在注射前要注意將懸液混勻。
　　3.3.2 卵巢原位移植模型的建立實驗動物麻醉，側(cè)臥位固定，取助下做側(cè)切口，切開皮膚肌層，暴露卵巢。在解剖顯微鏡下剪開卵巢白膜。將腫瘤細胞植入卵巢包膜，并用可吸收線縫合卵巢。逐層關(guān)腹。術(shù)后可給實驗動物注射青霉素以防術(shù)后感染。
　　3.3.3 其他移植模型的防立

　　①爪墊皮下移植模型的建立∶在動物模型爪墊內(nèi)側(cè)皮下注射細胞懸液，在這種方法中要將腫瘤組織制成細胞懸液。

　　②腹腔移植模型的建立∶取實驗動物，徒手固定后在腹腔注射腫瘤細胞懸液。細胞懸液數(shù)量要根據(jù)實驗動物重量確定。
　　移銪性組題德動物城型或商率高、實驗周期較短、不穩(wěn)定因素較少可重復性強。應(yīng)用廣泛。常用于抗癌藥物的篩選。因為這種移植方法可以使一群實驗動物帶有相同的腫瘤，成功率接近 100%。對實驗動物機體的影響類似。個體差異較小。可傳代移植。但對移植的腫瘤穩(wěn)定性要求較高，故而多進行傳代移植。以保證腫瘤的穩(wěn)定性。但移植性腫瘤無法體現(xiàn)卵巢癌發(fā)生過程，較少用于卵巢癌發(fā)病研究。
　　4 基因工程卵巢癌模型
　　20 世紀 70 年代，轉(zhuǎn)基因小鼠的成功研制為疾病研究提供了新思路，方法是將 DNA 序列克隆至實驗動物的生殖細胞系。或者使用制除或者敲除小鼠體內(nèi)基因的方法。定向生成特定基因的生殖細胞系。近幾年來，應(yīng)用基因工程改造建造小鼠的卵巢上皮性癌模型開始被越來越多的學者所接受，通過將腫瘤形成的有關(guān)基因轉(zhuǎn)入到動物體內(nèi)并使其進行表達的轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用也越來越廣泛。具體方法有轉(zhuǎn)基因模型和基因敲除模型。
　　4.1 轉(zhuǎn)基因卵巢癌動物模型
　　2003年C0NNOLLY等"成功建立，因早期SV40TAg基因受苗勒管抑制物Ⅱ（MISRI）基因啟動子的轉(zhuǎn)基因調(diào)控表達，所以CONNCLLY通過增強苗勒管抑制物Ⅱ而建立卵巢癌轉(zhuǎn)基因小鼠。該種模型表現(xiàn)為漿液性卵巢上皮性癌。
　　4.2 基因敲除卵巢癌動物模型
　　該種動物模型常用于研究卵巢癌的發(fā)生與各種因素的關(guān)系。2007年，CHEN X 等“”為研究卵巢癌的發(fā)生和排卵的關(guān)系，通過敲除卵泡刺激素受體基因而建立了FSHRKO小鼠，但這些小鼠仍有卵巢癌的發(fā)生，從而證實了卵巢癌的發(fā)生與排卵無關(guān)。ABEL M等“建立了散除卵泡刺激素 b至單位和 FSIRRO的小鼠模型。形成了的上皮性漿流性囊狀腺癌，其包含囊腫、年齡相關(guān)卵巢增生、管狀結(jié)構(gòu)均和臨床卵巢癌病理類似。此外，在一定條件下敲除小鼠卵巢顆粒細胞中的Breal基因，能誘導產(chǎn)生卵巢囊性腫瘤PiL
　　基因工程卵巢癌動物模型因其致癌過程和病理表現(xiàn)更接近人體，可以在自然的情況下使正常細胞演化成腫瘤細膽。并且可以完整地展現(xiàn)癌前病變，有助于卵巢癌的早期發(fā)現(xiàn)。適年來，基因工程動物模型越來越受到重視，但因其建立操作較為用難，對實驗室及實驗儀器要求較高，實驗周期較長，實驗動物間個體差異較大，實驗成本較高等缺點的存在，該種模型現(xiàn)階段使用較少。
　　5 小結(jié)
　　卵巢癌動物模型的發(fā)展很大程度上推動了卵巢癌的研究，有利于從多角度進行卵巢癌研究。基因工程小鼠（GBM）、同基因型腫瘤模型、異種移植瘤模型、活體動物體內(nèi)成像技術(shù)，這些技術(shù)的發(fā)展使得卵巢癌動物模型研究更加完善。移植性模型和誘導模型較多用于藥物篩選。自發(fā)性卵巢癌模型，基因工程卵巢癌模型更貼近人體卵巢癌的發(fā)生，常用于病理學研究，但與人體卵巢癌發(fā)生仍有差異，且存在實驗周期長，個體差異大等缺點。卵巢癌動物模型仍有完善的空間，有待于繼續(xù)研究和完善。