動物模型泛地應(yīng)用于卵巢癌的研究卵巢癌動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ驮炷７椒ǜ攀?

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2022-05-25

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卵巢癌動物模型的發(fā)展很大程度上推動了卵巢癌的研究，有利于從多角度進(jìn)行卵巢癌研究。基因工程小鼠（GBM）、同基因型腫瘤模型、異種移植瘤模型、活體動物體內(nèi)成像技術(shù)，這些技術(shù)的發(fā)展使得卵巢癌動物模型研究更加完善

　　摘要∶
　　卵巢癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，易發(fā)生廣泛的腹腔內(nèi)轉(zhuǎn)移，且預(yù)后較差，死亡率較高。近年來關(guān)于卵巢癌的研究越來越多，動物模型也廣泛地應(yīng)用于卵巢癌的研究中。建立卵巢癌動物模型有利于研究其誘導(dǎo)因素，發(fā)病機(jī)制，病理演變，病變轉(zhuǎn)移，以助于卵巢癌的早期發(fā)現(xiàn)。同時卵巢癌動物模型還可應(yīng)用于卵巢癌治療藥物的藥理學(xué)研究，以改善治療方案及預(yù)后。文章就常見卵巢癌動物模型分類，建立方法及應(yīng)用做一概述。
　　關(guān)鏈詞∶
　　卵巢癌;動物模型;動物造模方法
　　簡介
　　卵巢癌是常見的婦科惡性腫瘤疾病之一，因其病位居于盆腔深部，發(fā)病極具隱匿性，卵巢惡性腫瘤早期篩查及診斷困難，大多數(shù)患者首次就診時已為晚期，錯過了手術(shù)治療的最佳時機(jī)，致死率高，嚴(yán)重威脅女性身心健康。據(jù)國際癌癥機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的《2020 年全球癌癥統(tǒng)計》顯示，卵巢癌在該年全球女性新發(fā)癌癥中占比，3.4%，死亡率在其中占比4.7%，在女性癌癥發(fā)病及死亡順位中均為第 8 位1。在我國卵巢癌在女性惡性腫瘤及死亡順位中位居第11位及第9位。因此近年來，卵巢癌越來越受到關(guān)注，研究者們通過多種卵巢癌動物模型的建立及應(yīng)用探討卵巢癌的發(fā)生機(jī)制、發(fā)病規(guī)律及治療方案。目前，常用的卵巢癌模型有自發(fā)性卵巢癌動物模型、誘導(dǎo)性卵巢癌動物模型、移植性卵巢癌動物模型、基因工程卵巢癌動物模型，現(xiàn)對動物模型總結(jié)如下。
　　1 自發(fā)性卵巢癌動物模型
　　自發(fā)性腫瘤動物模型是不經(jīng)人為條件處理，自然產(chǎn)生的，是在長期動物實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)的易患該種疾病的動物品系，并人為促使其繁殖而形成的動物模型。現(xiàn)階段常用的卵巢癌自發(fā)性動物模型包括小鼠、東方田鼠及長爪沙鼠。其中因小鼠基因與人類基因的相似度高達(dá) 95%，所以小鼠自發(fā)性腫瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果類比干人有較大的優(yōu)熱，故本文主要以小鼠進(jìn)行闡述。實(shí)驗(yàn)人員在長期飼養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)以下小鼠品系中自發(fā)性卵巢癌的發(fā)病率較高∶RIⅢ系17月齡雌鼠卵巢影發(fā)病率在 50%～60%、C3H 系中C3HeB/Fe19月齡雌鼠卵巢癌發(fā)病率為22%～64%、CE 系推鼠發(fā)病率為33%。日發(fā)現(xiàn)同品系小鼠之間生產(chǎn)雌鼠較育成雌鼠發(fā)病率高【3】。腫瘤形成后可見腹部包塊，解剖提取卵巢包塊進(jìn)行病理切片，可見癌細(xì)胞可判斷模型建造成功。
　　自發(fā)性卵巢癌動物模型能夠完整地再現(xiàn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程，便干實(shí)驗(yàn)人員觀察卵巢癌的發(fā)病機(jī)制及病理演變過程，發(fā)現(xiàn)新的誘導(dǎo)因素，有利于進(jìn)行臨床卵巢癌的早期發(fā)現(xiàn)。同時實(shí)驗(yàn)所產(chǎn)生的自發(fā)性卵巢癌腫瘤可用干種精性腫瘤的細(xì)胞來源。但該種建模方法所需實(shí)驗(yàn)周期較長，實(shí)驗(yàn)動物體內(nèi)環(huán)境不能完全與人體內(nèi)環(huán)境相同，體內(nèi)免疫機(jī)制與人體免疫機(jī)制不同，其病理進(jìn)程與臨床病情仍存在較大出入，因此現(xiàn)階段較少在實(shí)驗(yàn)研究中應(yīng)用。
　　2 誘發(fā)性卵巢癌動物模型
　　誘發(fā)性腫瘤動物模型是指通過物理或化學(xué)方法人工誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)動物發(fā)病，生成腫瘤。在卵巢癌實(shí)驗(yàn)研究中，大多以大鼠為實(shí)驗(yàn)動物，使用化學(xué)物質(zhì)二羥甲基廠酸（DMBA）作為致癌物質(zhì)，誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)動物發(fā)病。在查閱資料時發(fā)現(xiàn)許多研究人員采取誘發(fā)模型進(jìn)行卵巢癌的相關(guān)研究，其建模方法雖各有差別但大部分采用【MBA 埋線法進(jìn)行誘導(dǎo)，該方法最早由 SEKIYA等于1975年采用，并成功誘導(dǎo)出卵巢癌模型，后經(jīng)多位學(xué)者驗(yàn)證。KANTER等于2006年在上述方法的基礎(chǔ)上構(gòu)建出了新的誘導(dǎo)模型-4-乙烯基-1-環(huán)己烯二環(huán)氧化物（-VCD）聯(lián)合MIBA 誘導(dǎo)法，這種方法是先運(yùn)用 VCD使實(shí)驗(yàn)動物產(chǎn)生卵巢早衰后用 DBA 誘導(dǎo)卵巢癌的發(fā)生。
　　下面將針對這兩種誘導(dǎo)模型的建立方法進(jìn)一步論述.
　　2.1 卵巢包埋DMIRA布片法
　　黃以萍等采用該種方法成功誘導(dǎo)大鼠卵巢癌模型具體方法如下1。首先將 DMBA 加熱至融化，后按照實(shí)驗(yàn)動物卵巢體積采取合適大小的布片，將布片浸泡于融化的BA中，-20℃冷藏保存。選取6周齡雌性實(shí)驗(yàn)動物稱重記錄后麻醉.待麻醉成功后選取雙側(cè)卵巢位置開題。尋找卵巢。將 DB4 布片經(jīng)貼哪巢包理在脂助下。逐層關(guān)感，后結(jié)喂養(yǎng)觀察實(shí)驗(yàn)動物情況，術(shù)后32 周后卵巢癌誘發(fā)率為 6錢，基本為上皮性師巢癌，均一性較好。
　　2.2 4-乙烯基-1-環(huán)己烯二環(huán)氧化物（-V①D）聯(lián)合DIBA 誘導(dǎo)法
　　實(shí)驗(yàn)研究表明每日予大鼠 4-乙烯基-1-環(huán)己烯二環(huán)氧化物（-VCD）可導(dǎo)致大鼠卵巢激素水平改變，發(fā)情周期素亂，卵泡數(shù)量減少，卵巢縮小。最絡(luò)導(dǎo)致卵巢功能衰竭。故而4-乙烯基-1-環(huán)己悟二環(huán)氧化物（VQD）常用做誘導(dǎo)大鼠卵巢早衰的實(shí)驗(yàn)試劑"問，也可前期運(yùn)用VCD.胸腔注射給藥，通過觀察大鼠發(fā)情情況來推測其卵巢早衰進(jìn)程，當(dāng)出現(xiàn)發(fā)情不規(guī)律時將MIBA浸泡的縫線包埋入大鼠卵巢，誘導(dǎo)大鼠卵巢癌的發(fā)生。
　　誘發(fā)性卵巢癌動物模型所產(chǎn)生的動物模型與人體模型病因?qū)W、人體腫瘤細(xì)胞動力學(xué)較為相似，可以較完整模擬卵巢癌在人體發(fā)病、演變的全過程。有利于卵巢癌預(yù)防和早期化療的研究。但誘發(fā)性卵巢癌模型發(fā)生步驟雖然與人體極為相似。但是其誘導(dǎo)產(chǎn)生的卵巢癌類型不易控制，黃以萍等在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)其誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)所建造的卵巢癌模型多為卵巢漿液性腺癌。而卵巢粘液性腺癌和卵巢透明細(xì)胞腺癌這兩種臨床預(yù)后最差的類型在實(shí)驗(yàn)中的發(fā)生率僅為 1.3%和 2.0%。誘發(fā)性卵巢癌的惡性程度也與臨床不盡相同。
　　3 移植性卵巢癌動物模型
　　移植性腫瘤動物模型即把人或動物的腫瘤移植到同系、同種或者異種動物體內(nèi)，現(xiàn)階段移植性卵巢癌動物實(shí)驗(yàn)常用實(shí)驗(yàn)動物多為小鼠，提鼠和大鼠。腫瘤來源可分為同種可移植腫瘤--自發(fā)性腫瘤、誘導(dǎo)性腫瘤，異種可移植腫瘤一人臨床實(shí)體瘤和人卵巢癌細(xì)胞棟。移植部位多選取皮下、卵巢移植。或者為研究卵巢癌的轉(zhuǎn)移情況、轉(zhuǎn)移癌的治療選取腹腔、淋巴移植。在查閱大量文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，我將從實(shí)驗(yàn)動物，腫瘤來源及處理方法，移植部位及方法這三個方面詳細(xì)論述。
　　3.1 實(shí)驗(yàn)動物的選擇
　　移植性卵巢癌動物模型常用動物有小鼠，裸鼠和大鼠。小鼠常用的品系是 BALB/c 小鼠、SCID 小鼠、C57BL/6J 小鼠。蔡智慧等"應(yīng)用 B.AB/c 雌性小鼠成功復(fù)制卵巢癌皮下種植模型，歐陽媛等一成功建造 NOD SCID 小鼠原位成瘤模型，張濤等構(gòu)建NSG小鼠卵巢皮下移植痛癌模型。小鼠作為實(shí)驗(yàn)動物起初較少選取人源腫瘤進(jìn)行移植，但宿主抗人組織的免疫排斥問題的解決，T、B、NK三系免疫細(xì)胞缺陷 NOD/SCID小鼠的應(yīng)用。患者源性異種移植逐漸開始被多數(shù)學(xué)者所選擇。所以現(xiàn)階段多種來源腫瘤皆可應(yīng)用于小鼠模型。在移植部位的選擇上，由于小鼠體積較小。60%以上選擇皮下移植。但也可進(jìn)行卵巢原位移植，首次小鼠卵巢原位移植是由 FU 等4于1993年首次嘗試并建造成功.
　　先天性無胸腺小鼠，T淋巴細(xì)胞功能缺陷小鼠一棵獻(xiàn)，因其個體之間可以保持同種遺傳性及生物學(xué)特性的特點(diǎn)，且其個體差異較小.重復(fù)性與可比性較高，在1969年由 YGAD等一首次應(yīng)用，是建立腫瘤模型常用的實(shí)驗(yàn)動物。根據(jù)查閱握鼠卵巢癌模型相關(guān)論文發(fā)現(xiàn)各種來源腫瘤皆可應(yīng)用于提鼠模型。提鼠模型的種植都位也可選擇皮下，卵巢原位、腹腔移植、淋巴移植。裸鼠模型比其小鼠和大鼠模型比較，其應(yīng)用更多。
　　但由于模鼠免疫缺乏的特點(diǎn)。無法模擬腫瘤細(xì)胞在機(jī)體內(nèi)生長所產(chǎn)生的免疫反應(yīng)，同樣不能完全模擔(dān)腫痛的發(fā)展過程，且對治療藥物的效果也無法精準(zhǔn)體現(xiàn)。而大鼠具備免疫功能，可以較好地模擬人卵巢癌的發(fā)展過程，常用于病理學(xué)研究、藥效研究、藥物篩查及相關(guān)干預(yù)因素研究。常用的卵巢癌大鼠品種有Fischer 大鼠"明、SD 大鼠P可等.
　　在實(shí)驗(yàn)動物的選擇上首先要從實(shí)驗(yàn)?zāi)康某霭l(fā)進(jìn)行選擇，同時若要進(jìn)行多次傳代移植時要盡量遵循同源移植。以保證移植的腫瘤不發(fā)生或最大程度地減少發(fā)生排斥、退化和變異。除此之外卵巢癌模型動物選擇時應(yīng)注意實(shí)驗(yàn)動物的月齡。
　　3.2 腫瘤未源分類及處理方法
　　3.2.1 人體腫瘤異種移植

　　腫瘤來源為臨床卵巢癌腫瘤，周艷艷等'選取臨床實(shí)體腫瘤，建立裸鼠皮下卵巢癌模型以探討萊藜對卵巢癌裸鼠生長的影響、IEE 等=一4也成功應(yīng)用人實(shí)體瘤建造裸鼠卵巢癌模型。經(jīng)大量實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，人體腫瘤初代移植成功率較低，平均只有 30%，故大多學(xué)者采用多次傳代移植，初代取實(shí)體瘤進(jìn)行皮下種植，再將成功成瘤的瘤體進(jìn)行分離、處理、再移植。其成功率約為 60%～70%。但由于臨床卵巢癌類型不同。人源性腫瘤可以保證動物模型成瘤的類型。有利于進(jìn)行藥效研究，但其需要進(jìn)行多次傳代移植，故而試驗(yàn)周期較長，成本較高。
　　3.2.2 腫瘤細(xì)胞株異體移植

　　細(xì)胞株移植法成功率較高，是現(xiàn)階段應(yīng)用較廣的腫瘤移植類型。常見的卵巢癌細(xì)胞株
　　有SSOV3細(xì)胞株、H0-8910細(xì)胞株、A2780細(xì)胞株、ID8細(xì)胞棟、C0C1細(xì)胞棟、BS-2細(xì)胞棟、CAOV-3細(xì)胞株和 0CAR-3 細(xì)胞棟等。腫瘤細(xì)胞棟異體移植實(shí)驗(yàn)前要進(jìn)行細(xì)胞扶體外培養(yǎng)。將購買的細(xì)胞族在含此牛血清的培養(yǎng)液中進(jìn)行培茶，要注意及時更換培養(yǎng)液。或者添加青霉素或其他抗菌素以防其他細(xì)菌滋生。待腫瘤傳代數(shù)量足夠后，收集對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行移植。宋燕琳及其團(tuán)隊(duì)的研究學(xué)者問通過對提鼠皮下注射人上皮性卵巢漿液性毒膜癌細(xì)胞H0991GPM （FSHR 陽性）及SKOW3（SER陰性），成功建立出了人卵巢癌細(xì)胞動物模型。旺E 等應(yīng)用此方法在小鼠卵巢中注入 ID8 細(xì)胞。成功備卵巢癌原位模型;ROS4等"研究學(xué)者在SIC模鼠胸腔內(nèi)注射SS、SKCC%2細(xì)胞，成功備提鼠卵巢癌模型∶任萍等i=將綠色熒光蛋白（GP）轉(zhuǎn)染后的SKOWV3 細(xì)胞以一定濃度種植于 MOD-SCID 鼠卵巢建立了卵巢癌原位模型。通過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，近年來人卵巢癌HO-8910細(xì)胞株的較為廣泛，郭秀霞等問應(yīng)用人卵巢癌 HO-8910細(xì)胞株建立了模鼠卵巢癌模型∶夏紅等一向提鼠腹腔注射 H0-8910細(xì)胞株建立卵巢癌動物模型。
　　應(yīng)用細(xì)胞懸液進(jìn)行移植較為方便，適合進(jìn)行腹腔轉(zhuǎn)移模型、淋巴轉(zhuǎn)移模型的建立，但形成卵巢癌類型不可控。要具體實(shí)驗(yàn)具體分析。
　　3.2.3 同種可移植腫瘤

　　同種可移植瘤即自發(fā)性或誘發(fā)性模型動物實(shí)驗(yàn)中形成的腫瘤。經(jīng)過人為處理后移植進(jìn)相同種屬實(shí)驗(yàn)動物體內(nèi)。同種移植瘤正常速度較快，機(jī)體排斥反應(yīng)較輕。同為瘤組織移植，成功率要高于臨床人痛組織移植。其瘤體處理方法同臨床實(shí)體瘤相似。但應(yīng)注意移植實(shí)驗(yàn)動物種類要同腫瘤來源的實(shí)驗(yàn)動物相同。該種來源腫瘤因取自自發(fā)性或誘發(fā)性試驗(yàn)?zāi)Ｅe.實(shí)驗(yàn)周期相對較長，種植部位以往大多選取皮下或卵巢原位移植。3.3 種植部位的選擇及方法卵巢癌模型常用種植部位有皮下，爪墊皮下、卵巢及腹腔，皮下移植操作簡單，但不能完個模擬瘤體在卵巢內(nèi)的生長，太多用于藥效的研究。爪擋皮下淋巴管較為豐寬。成單向淋巴引流，便于進(jìn)行服巢癌淋巴轉(zhuǎn)移的研究。種植方便，成痛率高，易于觀察。但建模成功后不易進(jìn)行定量分析研究。卵巢原位移植可完整模擬腫瘤在卵巢癌內(nèi)的生長過程，有利于進(jìn)行病理及藥理的研究，但由于實(shí)驗(yàn)動物卵巢體積較小，實(shí)驗(yàn)操作難度較大。臨床上卵巢癌易于向腹腔轉(zhuǎn)移，腹腔種植模型的建立有利于模擬這一轉(zhuǎn)移過程，并對卵巢癌腹腔轉(zhuǎn)移后的治療進(jìn)行研究。
　　3.3.1 皮下種植模型的建立

　　①瘤組織組織塊移植∶常用的方法為穿刺針法。首先抓取動物。固定，選好皮下種植部位并消毒，用合適型號的套管針將剪好的瘤組織移至小鼠皮下。

　　②腫瘤細(xì)胞懸液種植∶懸液種植常用部位為頸背部皮膚。抓取動物并固定，消毒局部皮膚。一般按照每只動物0.2mL.懸液進(jìn)行注射。在注射前要注意將懸液混勻。
　　3.3.2 卵巢原位移植模型的建立實(shí)驗(yàn)動物麻醉，側(cè)臥位固定，取助下做側(cè)切口，切開皮膚肌層，暴露卵巢。在解剖顯微鏡下剪開卵巢白膜。將腫瘤細(xì)胞植入卵巢包膜，并用可吸收線縫合卵巢。逐層關(guān)腹。術(shù)后可給實(shí)驗(yàn)動物注射青霉素以防術(shù)后感染。
　　3.3.3 其他移植模型的防立

　　①爪墊皮下移植模型的建立∶在動物模型爪墊內(nèi)側(cè)皮下注射細(xì)胞懸液，在這種方法中要將腫瘤組織制成細(xì)胞懸液。

　　②腹腔移植模型的建立∶取實(shí)驗(yàn)動物，徒手固定后在腹腔注射腫瘤細(xì)胞懸液。細(xì)胞懸液數(shù)量要根據(jù)實(shí)驗(yàn)動物重量確定。
　　移銪性組題德動物城型或商率高、實(shí)驗(yàn)周期較短、不穩(wěn)定因素較少可重復(fù)性強(qiáng)。應(yīng)用廣泛。常用于抗癌藥物的篩選。因?yàn)檫@種移植方法可以使一群實(shí)驗(yàn)動物帶有相同的腫瘤，成功率接近 100%。對實(shí)驗(yàn)動物機(jī)體的影響類似。個體差異較小。可傳代移植。但對移植的腫瘤穩(wěn)定性要求較高，故而多進(jìn)行傳代移植。以保證腫瘤的穩(wěn)定性。但移植性腫瘤無法體現(xiàn)卵巢癌發(fā)生過程，較少用于卵巢癌發(fā)病研究。
　　4 基因工程卵巢癌模型
　　20 世紀(jì) 70 年代，轉(zhuǎn)基因小鼠的成功研制為疾病研究提供了新思路，方法是將 DNA 序列克隆至實(shí)驗(yàn)動物的生殖細(xì)胞系。或者使用制除或者敲除小鼠體內(nèi)基因的方法。定向生成特定基因的生殖細(xì)胞系。近幾年來，應(yīng)用基因工程改造建造小鼠的卵巢上皮性癌模型開始被越來越多的學(xué)者所接受，通過將腫瘤形成的有關(guān)基因轉(zhuǎn)入到動物體內(nèi)并使其進(jìn)行表達(dá)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用也越來越廣泛。具體方法有轉(zhuǎn)基因模型和基因敲除模型。
　　4.1 轉(zhuǎn)基因卵巢癌動物模型
　　2003年C0NNOLLY等"成功建立，因早期SV40TAg基因受苗勒管抑制物Ⅱ（MISRI）基因啟動子的轉(zhuǎn)基因調(diào)控表達(dá)，所以CONNCLLY通過增強(qiáng)苗勒管抑制物Ⅱ而建立卵巢癌轉(zhuǎn)基因小鼠。該種模型表現(xiàn)為漿液性卵巢上皮性癌。
　　4.2 基因敲除卵巢癌動物模型
　　該種動物模型常用于研究卵巢癌的發(fā)生與各種因素的關(guān)系。2007年，CHEN X 等“”為研究卵巢癌的發(fā)生和排卵的關(guān)系，通過敲除卵泡刺激素受體基因而建立了FSHRKO小鼠，但這些小鼠仍有卵巢癌的發(fā)生，從而證實(shí)了卵巢癌的發(fā)生與排卵無關(guān)。ABEL M等“建立了散除卵泡刺激素 b至單位和 FSIRRO的小鼠模型。形成了的上皮性漿流性囊狀腺癌，其包含囊腫、年齡相關(guān)卵巢增生、管狀結(jié)構(gòu)均和臨床卵巢癌病理類似。此外，在一定條件下敲除小鼠卵巢顆粒細(xì)胞中的Breal基因，能誘導(dǎo)產(chǎn)生卵巢囊性腫瘤PiL
　　基因工程卵巢癌動物模型因其致癌過程和病理表現(xiàn)更接近人體，可以在自然的情況下使正常細(xì)胞演化成腫瘤細(xì)膽。并且可以完整地展現(xiàn)癌前病變，有助于卵巢癌的早期發(fā)現(xiàn)。適年來，基因工程動物模型越來越受到重視，但因其建立操作較為用難，對實(shí)驗(yàn)室及實(shí)驗(yàn)儀器要求較高，實(shí)驗(yàn)周期較長，實(shí)驗(yàn)動物間個體差異較大，實(shí)驗(yàn)成本較高等缺點(diǎn)的存在，該種模型現(xiàn)階段使用較少。
　　5 小結(jié)
　　卵巢癌動物模型的發(fā)展很大程度上推動了卵巢癌的研究，有利于從多角度進(jìn)行卵巢癌研究。基因工程小鼠（GBM）、同基因型腫瘤模型、異種移植瘤模型、活體動物體內(nèi)成像技術(shù)，這些技術(shù)的發(fā)展使得卵巢癌動物模型研究更加完善。移植性模型和誘導(dǎo)模型較多用于藥物篩選。自發(fā)性卵巢癌模型，基因工程卵巢癌模型更貼近人體卵巢癌的發(fā)生，常用于病理學(xué)研究，但與人體卵巢癌發(fā)生仍有差異，且存在實(shí)驗(yàn)周期長，個體差異大等缺點(diǎn)。卵巢癌動物模型仍有完善的空間，有待于繼續(xù)研究和完善。