通過乳腺癌 MCF-7細胞系建立乳腺癌裸鼠皮下移植瘤動物模型 CYB5D2 對乳腺癌皮下移植瘤模型大鼠腫瘤生長的影響
發布時間：
2022-06-06
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摘要∶
CYB5D2蛋白是一種神經營養因子，可通過抑制細胞增殖促進神經元分化，隨著研究深入，有學者發現1-司CYB5D2 還參與乳腺癌、宮頸癌、肝癌等多種惡性腫瘤的發生及進展，是多種腫瘤的候選抑癌因子。上皮細胞間質轉化（epithelial- mesenchymal transition，EMT）是惡性腫瘤發生及發展過程中的重要病理機制，EMT過程中，上皮細胞極性喪失，同時獲得浸潤性與遷移能力團。
為研究 CYB5D2是否通過EMT來調控乳腺癌的發生及發展，筆者建立 20 只乳腺癌皮下轉移瘤動物模型大鼠，通過分析不同處理組大鼠轉移瘤組織內 EMT相關蛋白質表達情況，探究CYB5D2 在乳腺癌中作用機制。
目的：
研究CYB5D2對乳腺癌皮下移植瘤模型大鼠腫瘤生長的影響。
方法：
通過乳腺癌 MCF-7細胞系建立乳腺癌裸鼠皮下移植瘤動物模型。將含有CYB5D2 表達的質粒穩定轉染 MCF-7細胞，多點注射，將穩定轉染的細胞注入裸鼠皮下，作為觀察組，同時設置 shRNA-CYB5D2陰性質粒為陰性對照組，PBS為空白對照組。測量各組大鼠腫瘤體積及質量;裸鼠轉移瘤模型建立成功后處死小鼠，qRT-CPR 法檢測腫瘤組織內CYB5D2 mRNA 表達水平;Western Blot 法檢測各組裸鼠轉移瘤組織內上皮細胞間質轉化（EMT）標志表白表達情況，酶聯免疫吸附法檢測裸鼠轉移瘤細胞上清液中MMP-2及 MMP-9水平。
結果：
觀察組轉移瘤平均體積及質量顯著低于陰性組與空白組（P<0.05），陰性組與空白組裸鼠轉移瘤體積及質量無明顯差異（P>0.05）。提取試驗小鼠腫瘤組織總 RNA，qRT-CPR 法檢測提示觀察組腫瘤組織內CYB5D2 mRNA表達量顯著高于陰性組及空白對照組（P<0.05），而陰性組與空白組間差異無顯著性差異（P>0.05）;Western Blot 法檢測結果顯示，觀察組轉移瘤組織內E-cadherin、β-catenin 蛋白表達水平顯著高于與陰性組及空白組（P<0.05），而N-cadherin 及 Snail蛋白表達顯著低于與陰性組及空白組（P<0.05）。陰性組與空白組轉移瘤組織內E-cadherin、β-catenin、N-cadherin及 Snail 蛋白表達無顯著性差異（P>0.05）;觀察組裸鼠轉移瘤細胞上清液中 MMP-2及 MMP-9水平顯著低于與陰性組及空白組（P<0.05）），而陰性組與對照組 MMP-2 及 MMP-9水平無顯著性差異（P>0.05。
結論：
上調CYB5D2基因可有效抑制乳腺癌皮下移植模型大鼠瘤體生長，推測上調CYB5D2基因可能通過下調N-cadherin、Snail、MMP2及 MMP9，上調E-cadherin、β-catenin，逆轉 EMT，發揮抗腫瘤功效。
關鍵詞∶
CYB5D2;乳腺癌;皮下移植瘤大鼠動物模型;腫瘤生長
討論：
乳腺癌已成為女性群體中發病率最高的惡性病變，嚴重威脅女性生命健康。探究乳腺癌病因，尋找有效的治療方法一直是臨床研究的住點。本文通過小鼠肩胛皮下組織注射乳腺癌 MCF-7細胞，建立乳腺癌皮下轉移瘤模型大鼠，并在體外構建 CYB5D2 基因穩定轉染上調的 MCF-7細胞與穩定轉染下調的 MCF-7 細胞;分別注射至乳腺癌皮下轉移痛模型大做皮下組織，并設置為觀察組、陰性組及空白組（注射空白質粒轉染的 MCF-7細胞）。注射完畢后第5d開始測量模型大鼠轉移瘤體積及重量，結果發現，與陰性組及空白組相比，注射 CYB5D2基因穩定轉染上調 MCF-7細胞的觀察組大鼠轉移瘤體積及重量明顯減輕，提示 CYB5D2基因表達上調可有效抑制乳腺癌腫瘤的生長。
EMIT是上皮源惡性腫痛發生侵襲轉移的預程序，經歷 EMIT 反應的腫瘤細胞，其上皮性表性標志蛋白包括E-cdherin、B-catenin、Cladin 等表達水平將明顯下降，與此同時，間質性表型蛋白如 N-cadherin、Vimentin 等表達水平上升-0。其中E-cadherin是腫瘤細胞 EMTT進程中的關鍵蛋白，E一cadherin 蛋白在浸潤性癌細胞系中的重新表達可有效降低浸潤性細胞體外侵襲能力以。B-catenin 則可直接與E-cadherin 結合為復合物，保障細胞間緊密相連，同時，β-catenin 還是 Wnt 信號通路的核心蛋白，可激活Wnt 途徑，誘導 EMIT轉錄因子 Snail、Twit 等表達產物四。其中 Snal是一種含鋅指結構的DNA結合蛋白，具有抑制E-cadheri蛋白啟動子活性的生物功能，誘導EMT發生貝。檢測組織細胞EMT相關蛋白表達情況，可有效判斷其EMT狀況，推測目的基因在乳腺癌發生及發展中的作用
本文研究發現，觀察組乳腺癌轉移瘤瘤體細胞內E-cadherin、β-calenin蛋白表達水平顯著高于與陰性組及空白組，而N-cadherin及Snail蛋白表達顯著低于與陰性組及空白組。提示上調CYB5D2 基因可能上調E-cadberin、β-catenin蛋白，下調N -cadherin及Snail蛋白，進而抑制乳腺癌裸鼠皮下轉移瘤的生長。
此外，金屬基質蛋白酶家族（MMPs）是腫瘤侵潤及轉移的敏感標志物，其可重塑腫瘤微環境，并誘導大量血管生長，進而促進腫瘤浸潤及轉移D-四. MMP-2及MMP-9是MMPs中最重要的兩個成員。有研究顯示叫，MMP9與卵巢癌組織中呈高表達狀態，且與Snail呈正相關，與E-cadherin呈負相關。Liu D等研究發現，MMP2可通過EMT途徑促使肝癌侵襲及轉移。總而言之，MMP2及MMP9 在惡性腫瘤侵襲及轉移中具有重要意義。本文研究發現，觀察組試驗大鼠移植瘤組織細胞內MMP2及MMP9濃度均顯著低于陰性組及對照組，提示上調CYB5D2基因可有效減輕乳腺癌組織內MMP2及MMP表達，推測上調CYB5D2基因可抑制乳腺癌細胞侵襲及轉移。
結論：
上調CYB5D2基因可有效抑制乳腺癌皮下移植模型大鼠瘤體生長，推測上調CYB5D2 基因可能通過下調 N-cadherin、Snail、MMP2及 MMP9，上調 E -cadherin、β-catenin，逆轉 EMT，發揮抗腫瘤功效。
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