通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探討Vp在實(shí)驗(yàn)性哮喘氣道重塑中的作用機(jī)制

發(fā)布時(shí)間：

2022-07-14

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研究發(fā)現(xiàn)，全球約有哮喘患者3.58億P，我國(guó)成年哮喘患者多達(dá)4570萬(wàn)“，哮喘已成為全球性重大公共衛(wèi)生問(wèn)題。氣道重塑不同程度地參與哮喘疾病進(jìn)程，是哮喘出現(xiàn)不可逆氣流受限、激素敏感性降低、哮喘病情持續(xù)加重的關(guān)鍵因素，其病理特點(diǎn)為氣道平滑肌細(xì)胞（airway smooth muscle cell，ASMC）增生肥厚，且增生程度越重病情越重ISAL

　　摘要
　　哮喘是一種慢性氣道炎癥性疾病，其特征為可逆性氣流受限及氣道高反應(yīng)性1-2。
　　研究發(fā)現(xiàn)，全球約有哮喘患者3.58億P，我國(guó)成年哮喘患者多達(dá)4570萬(wàn)“，哮喘已成為全球性重大公共衛(wèi)生問(wèn)題。氣道重塑不同程度地參與哮喘疾病進(jìn)程，是哮喘出現(xiàn)不可逆氣流受限、激素敏感性降低、哮喘病情持續(xù)加重的關(guān)鍵因素，其病理特點(diǎn)為氣道平滑肌細(xì)胞（airway smooth muscle cell，ASMC）增生肥厚，且增生程度越重病情越重ISAL。
　　相關(guān)蛋白（Yes-associated protein，YAP）通路可通過(guò)磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)調(diào)控細(xì)胞的增殖和凋亡，抑制血管平滑肌細(xì)胞中該通路的活性，可使下游分子YAP磷酸化（phosphorylated YAP，p-YAP）水平降低，YAP轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞核，與TEA 結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子（TEA dornain transcription factor，TEAD）結(jié)合并激活下游靶基因，引發(fā)一系列心血管疾病79。維替泊芬（verteporfin，Vp）是治療新生血管黃斑變性的藥物，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，其可改變YAP的空間構(gòu)象而抑制YAP與TEAD的結(jié)合，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的過(guò)度增殖10。
　　與血管平滑肌細(xì)胞具有高度同源性，而Vp在哮喘氣道重塑中的作用尚不清楚。本研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探討Vp在實(shí)驗(yàn)性哮喘氣道重塑中的作用機(jī)制。
　　目的
　　探討維替泊芬（Vp）在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)性哮喘氣道重塑中的作用及其機(jī)制。
　　方法
　　（1）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)∶將12只雌性BALB/c小鼠分為對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)性哮喘組與Vp干預(yù)組，每組4只。
　　實(shí)驗(yàn)性哮喘組小鼠使用屋塵螨提取液（HDM）滴鼻建立哮喘模型，Vp 干預(yù)組在HDM激發(fā)前腹腔注射Vp進(jìn)行干預(yù)，對(duì)照組使用等量生理鹽水。
　　收集小鼠肺組織及支氣管肺泡灌洗液（BALF），采用HE染色、Masson染色、過(guò)碘酸雪夫（PAS）染色觀察肺組織病理變化，瑞氏-吉姆薩染色計(jì)數(shù)BALF中炎性細(xì)胞采用免疫組化檢測(cè)肺組織中 Yes 相關(guān)蛋白（YAP）、磷酸化 Yes相關(guān)蛋白（p-YAP）的表達(dá)情況，RT-PCR、Western blotting 檢測(cè)肺組織中YAP、p-YAP、骨橋蛋白（OPN）、平滑肌肌球蛋白重鏈（SMMHC）的表達(dá)情況。
　　（2）細(xì)胞實(shí)驗(yàn)∶將人氣道平滑肌細(xì)胞（HASMC）分為HDM組（加入50ug/ml HDM作用24h）、HDM+Vp組（加入0.05mgLVp刺激2h后，加入50μg/mlHDM作用24hy與對(duì)照組（加入等量生理鹽水），采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，Western bloting檢測(cè)YAP、OPN、SMMHC蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果
　　（1）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)性哮喘組肺組織炎癥較對(duì)照組加重，支氣管基底膜、氣道平滑肌及支氣管管壁明顯增厚1.1340.38）um ts.（0.7940.36）μm，（6.49±2.36）pm y5.（4.56±1.52）m，（33.85±5.95）μm ×××（22.08±3.30）m，P<0.05，氣道周圍膠原纖維沉積面積、PAS染色陽(yáng)性面積明顯增多（5.85%±2.35% vx 0.36%±0.12%，28.81%=5.89% vs. 13.57%±2.08%，P<0.01），肺組織中YAP、OPNmRNA和蛋白表達(dá)水平升高（P<05或P<0.01），p-YAP/YAP比值，SMMHCmRNA 和蛋白表達(dá)水平明顯下降（P<0.05或F<0.01）。
　　與實(shí)驗(yàn)性哮喘組比較，Vp干預(yù)組小鼠肺組織炎癥減輕，支氣管基底膜、氣道平滑肌及支氣管管壁明顯變薄【0.9340.27） um、（4.9941.75）μm、（26.59±2.76）μm，P<0.05），氣道周圍膠原纖維沉積面積、PAS 染色陽(yáng)性面積明顯減少（2.14%40.89%、17.92%±1.89%，P<0.05），肺組織 YAP、OPN mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低（P<0.05 或P<0.01），p-YAPYYAP比值、SMMFC mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯增高（P<05）。
　　（2）細(xì)胞實(shí)驗(yàn)HDM組細(xì)胞增殖能力較對(duì)照組增強(qiáng)（0.287440.0055 ws.0.2626±0.0051，P<0.01）、凋亡率降低（5.14%40.82% ws.6.75%±0.21%，P<0.05），YAP、OPN蛋白表達(dá)升高（3.1440.48 vx 1.51±0.61，5.87±2.42vx vx 0.940.23，P<0.01），SMHC蛋白表達(dá)降低（0.80.19×.2.96±0.96，P<0.01）。
　　組細(xì)胞增殖能力較HDM組減弱（0.2748±0.0043，P<0.05）、凋亡率升高（6.29%+0.49%，P<05），YAP、OPN蛋白表達(dá)下降（2.02#0.53、2.93±1.09，P<0.05），SMMHC蛋白表達(dá)升高（2.11±0.85，P<0.05）。
　　結(jié)論
　　可通過(guò)降低YAP的表達(dá)、減少YAP核移位、逆轉(zhuǎn)HASMC表型轉(zhuǎn)化而抑制實(shí)驗(yàn)性哮喘氣道重塑。
　　關(guān)鍵詞
　　動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，Hippo/YAP信號(hào)通路，維替泊芬，哮喘，氣道重塑