可注射凝膠材料腫瘤術(shù)后疫苗用于結(jié)直腸癌免疫治療大鼠動物模型實驗研究

發(fā)布時間：

2022-07-20

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專業(yè)提供(ATCC,DSMZ,RCB,JCRB細胞庫源細胞、動物實驗、CRO服務(wù)、SCI潤色)

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在這項研究中，我們提出了一種用于術(shù)后腫瘤治療的 DCHVax 個性化癌癥疫苗平臺。我們的研究結(jié)果嚴(yán)格證實了DCHVax平臺能有效地抑制腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)，顯著延長小鼠存活時間。與目前報道的個性化癌癥疫苗方法相比，這個平臺簡單、高效、經(jīng)濟有效，而且普遍適用。因此，我們認(rèn)為DCHVax平臺對于腫瘤術(shù)后治療，特別是晚期腫瘤的臨床應(yīng)用具有重要意義

　　關(guān)鍵詞
　　大鼠腫瘤動物模型,腫瘤模型,大鼠動物模型,癌癥免疫治療,癌癥疫苗,水凝膠,生物材料,個性化腫瘤疫苗模型,個性化精準(zhǔn)治療
　　簡介
　　結(jié)直腸癌（Colorectal cancer，CRC）為全球上第三大最普遍的癌癥，其發(fā)病率和死亡率在全球不斷上升。除了人口老化及高收入國家的生活飲食外，肥胖、缺乏日常鍛煉及吸煙等不良好因素發(fā)生的概率將能夠增加結(jié)直腸癌的患病機率。病理生理學(xué)的發(fā)展提升了一部分及晚期疾病的治療抉擇，加強了個體化治療的發(fā)展。結(jié)直腸癌的經(jīng)典治療模式通常為手術(shù)、化療及放射療法，這些方法可以用來聯(lián)合治療患者。然而，這類治療手段存在著很多的負(fù)作用，因為它們針對于正常細胞增長及分裂存在著較大的細胞毒性。此外，許多患者經(jīng)過多層次治療，依舊會面臨著腫瘤再次復(fù)發(fā)的風(fēng)險。所以，尋找高效的替代治療方法對于治療結(jié)腸癌患者至關(guān)重要。
　　免疫療法是癌癥治療的新選擇之一。免疫療法的策略是利用病人自身的免疫系統(tǒng)來對抗癌細胞。一些癌癥免疫治療的結(jié)果在某些情況下是驚人的，但是一些依賴于患者自身免疫系統(tǒng)狀態(tài)的情況病人則并非如此。那些對癌癥免疫治療反應(yīng)良好的患者有更好的預(yù)后和生活質(zhì)量。癌癥治療正迅速進入免疫治療時代，癌癥疫苗被認(rèn)為是最有前途的癌癥免疫治療方法。然而，目前抗癌疫苗研究的進展仍然有限和緩慢，部分原因是在確定和獲得腫瘤特異性抗原方面的困難。考慮到在大多數(shù)情況下手術(shù)是腫瘤治療的首選，我們是否可以直接從切除的腫瘤中提取抗原用于設(shè)計個體化的腫瘤疫苗基于可注射凝膠材料的術(shù)后疫苗局部免疫療法，成為腫瘤切除術(shù)后免疫治療的一種新型策略和途徑，主要包括可注射水凝膠和原位形成的水凝膠等方式。近年來的研究表明，該治療方式具有易于裝載、可降解和控制緩釋特性，表現(xiàn)出重要的治療力。這類部分免疫治療可能夠出現(xiàn)周身抗腫瘤免疫功效，或者達成治療的功效。
　　對于這一路徑，因此，我們設(shè)計了一種基于可注射凝膠的腫瘤疫苗（DCHVax），用于腫瘤手術(shù)后的個性化治療。以切除腫瘤的蛋白質(zhì)為抗原，CpG/聚乙烯亞胺復(fù)合物為佐劑，以多臂聚乙二醇（8-arm PEG-NHz）/氧化葡聚糖（ODEX）動態(tài)交聯(lián)水凝膠為基質(zhì)。DCHVax的皮下注射原位招募樹突狀細胞，并誘發(fā)其強大的腫瘤特異性免疫反應(yīng)。我們的結(jié)果顯示，它能有效地抑制小鼠腫瘤模型術(shù)后殘留腫瘤的生長。這種簡單而個性化的癌癥疫苗開發(fā)方法有望成為臨床相關(guān)的癌癥術(shù)后治療方案。
　　目的
　　利用外科醫(yī)生在結(jié)直腸癌手術(shù)中直接接觸腫瘤的條件，創(chuàng)建一類對于可注射凝膠的腫瘤疫苗（DCHVax）能夠適用在發(fā)展期結(jié)直腸癌術(shù)后免疫治療，用以處理結(jié)直腸癌醫(yī)療之后復(fù)發(fā)的疑惑。
　　方法
　　（1）研制空白可注射動態(tài)共價水凝膠∶用不等量質(zhì)量比的8-arm PEG-NH及ODEX交聯(lián)，經(jīng)過醛基和氨基的席夫堿反應(yīng)（Schiff base reaction）組合成交聯(lián)網(wǎng)格的水凝膠，并依次檢測不同類別質(zhì)量比研制的可注射動態(tài)共價水凝膠強度及粘結(jié)性，依照檢測成果挑選出最優(yōu)的質(zhì)量比
　　（2）可注射動態(tài)共價水凝膠的現(xiàn)狀∶檢測出最好質(zhì)量比情形之下研制的水凝膠基于體內(nèi)及體外的溶解情形；
　　（3）含有模型抗原的動態(tài)共價水凝膠疫苗（DCHVax）的制備∶將模型抗原 OVA 以及佐劑（CpG/PEI）擔(dān)載到可注射動態(tài)共價水凝膠中，并測試其緩釋效果
　　（4）腫瘤中抗原蛋白的提取當(dāng)腫瘤體積達到200mm?左右時，從小鼠體內(nèi)切除 MC38或 CT26腫瘤細胞，制備出抗原，用 BCA 法測定蛋白質(zhì)抗原的含量，定量備用
　　（5）動態(tài)共價水凝膠疫苗（DCHVax）的制備將佐劑（CpG/PEI）和腫瘤中提取的抗原蛋白擔(dān)載到可注射動態(tài)共價水凝膠中，并測試其緩釋效果
　　（6）動態(tài)共價水凝膠疫苗（DCHVax）殺滅殘留腫瘤效果的驗證∶構(gòu)建BALB/c小白鼠和C57BL/6小黑鼠皮下結(jié)腸癌CT26、MC38細胞不完全切除腫瘤模型，術(shù)中將DCHVax注射到小鼠腋下淋巴結(jié)處，檢測同時保存殘留腫瘤增長形式；同時研究注射后第3天及第10天留存的腫瘤免疫細微生長環(huán)境的變化；
　　（7）動態(tài)共價水凝膠疫苗（DCHVax）治療之后的腫瘤特殊性免疫記憶效應(yīng)的檢驗∶皮下未全部根除腫瘤模型里面通過DCHVax 治療的小鼠，檢驗同時記載腫瘤增長形式同時研究系統(tǒng)性免疫細微生存狀態(tài)（血液及脾臟）的變化
　　結(jié)果
　　（1）當(dāng)8-am PEG-NH與ODEX的質(zhì)量比為11時，交聯(lián)形成的可注射動態(tài)共價水凝膠同時存在很強的強度及優(yōu)異的系統(tǒng)粘結(jié)性基于身體外，能夠注射動態(tài)共價水凝膠溶解時間是18天基于身體里面，這種溶解時間超過18天；
　　（2）模型抗原B16-OVA裝載及驗證，CT26/MC38抗原蛋白被成功提取，并與佐劑（CpG/PEI）被成功裝載到可注射動態(tài)共價水凝膠中制成腫瘤疫苗DCHVax，并且能夠隨著DCHVax的降解而同步釋放，抗原蛋白和佐劑CpG/PEI的釋放時間均達到18天；
　　（3）在皮下不完全切除腫瘤模型中，術(shù)中將DCHVax注射到小鼠腋下淋巴結(jié)處，顯著抑制了腫瘤的再生長。殘留腫瘤免疫微環(huán)境分析結(jié)果顯示∶在術(shù)之后治療第3天，本來存在的免疫被快速激活，自然殺傷細胞（Nature killer cells，NK 細胞）的浸潤提升，樹突狀細胞（Dendritic cells，DCs）的活化顯著提升，之后適應(yīng)環(huán)境性能免疫能夠被激活，腫瘤里面T細胞浸潤數(shù)目明顯提升（第6天）
　　（4）皮下不完全切除腫瘤模型中，搭載OVA模型抗原制備而成的DCHVax-OVA，在對不同分組的B16-OVA小鼠模型進行治療發(fā)現(xiàn)，經(jīng)DCHVax-OVA治療后結(jié)果顯示∶血液及脾臟內(nèi)記憶T細胞數(shù)量顯著增多
　　（5）皮下不完全切除腫瘤模型中，搭載我們從腫瘤組織中提取的MC38模型抗原制備而成的DCHVax-MC38，在對不同分組的MC38 小鼠模型進行治療發(fā)現(xiàn)，經(jīng)DCHVax-MC38治療后監(jiān)測并記錄腫瘤生長情況全身系統(tǒng)性免疫分析結(jié)果顯示∶血液及脾臟內(nèi)記憶T細胞數(shù)量顯著增多
　　（6）為此我們進行了多種腫瘤模型的驗證，在皮下不完全切除腫瘤模型中，術(shù)中將DCHVax-CT26注射到小鼠腋下淋巴結(jié)處，同樣顯著抑制了CT26腫瘤的再生長。
　　結(jié)論
　　在這項研究中，我們提出了一種用于術(shù)后腫瘤治療的 DCHVax 個性化癌癥疫苗平臺。我們的研究結(jié)果嚴(yán)格證實了DCHVax平臺能有效地抑制腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)，顯著延長小鼠存活時間。與目前報道的個性化癌癥疫苗方法相比，這個平臺簡單、高效、經(jīng)濟有效，而且普遍適用。因此，我們認(rèn)為DCHVax平臺對于腫瘤術(shù)后治療，特別是晚期腫瘤的臨床應(yīng)用具有重要意義。